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          • 產品名稱:Percoll細胞分離液
          • 產品貨號:17-0891-01
          • 產品規格:1L
          • 產品品牌:GE
          • 供應商:GE
          • 產品產地: GE 產品價格:¥詢價
          • 產品說明書:
          • 保存于運輸說明:
          • RT
          • 詳細信息:
          •  Percoll不連續密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞

              () 原理
            Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosmkg HO), 粘度也很小,可形成高達1.3gml密度,采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(2001000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低,所形成的梯度十分穩定。此外,Percoll不穿透生物膜,對細胞無毒害,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒,還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。
            ()操作方法及注意事項
            1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備先用9Percoll18.5 NaCl1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85 NaCl0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
            Percoll濃度()  70    60    50    40    30     20
              比重gml     1.090     1.077     1.067     1.056     1.043       1.031
                2.不連續密度梯度Percoll層的制備先將試管壁用牛血清濕潤,除去多余血清,這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。
                3.裝樣:樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。
                4
            .離心:一般采用離心力為400g,時間2025min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機加速、降速時要慢,要平穩。
                5.
            取樣:當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時,可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。
            ()分離純化細胞舉例
            1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll1.21.5ml,初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1ml培基中,按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
                2.
            純化淋巴母細胞和除去死細胞:分別疊加50%和30Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者),按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞;兩層Percoll之間為淋巴母細胞,純度和回收率在80%以上,位于30Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
            () 人不同血細胞的漂浮密度
            表   人不同血細胞的漂浮密度
            ──────────────┬──────────────────
               細 胞   漂浮密度    │ 細 胞       漂浮密度
            ──────────────┼──────────────────
               紅細胞  1.09-1.11     淋巴細胞       1.052-1.077
               粒細胞            │ B淋巴細胞      1.062-1.075
               嗜酸性  1.09-1.095     │ T淋巴細胞      1.065-1.077
               嗜中性  1.080-1.085    │ 淋巴母細胞     1.065-1.077
               單核細胞 1.050-1.066    自然殺傷細胞     1.050-1.070
               血小板  1.030-1.060    
               ──────────────┴──────────────────
                 (
            )問與答 

            問:
            請問percoll連續梯度怎么配制?比如15%---75%percoll連續梯度?
            答:
            根據你需要的具體密度梯度決定的,根據要分離的不同細胞種類,數量等等,也有用原液配的。也有用80%配的,不一定的。另外,percoll本身是低滲透壓的,要用高滲透壓溶液配成生理等滲透壓溶液,然后使用,不然,細胞容易破裂。一般是先用9Percoll18.5 NaCl1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85 NaCl0.15M PBS)稀釋到所需濃度。即取Percoll原液與10倍濃縮的PBS91的比例混合,此時溶液 100 Percoll,比重是1.127,毫克分子滲透壓濃度為290mOsmol/kg 
            Percoll
            濃度()  70     60      50      40      30       20 
            比重gml      1.090  1.077    1.067   1.056   1.043    1.031

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